デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する分子治療のこころみ

武田　伸一，吉村　まどか

国立精神・神経センター神経研究所　遺伝子疾患治療研究部
e-mail address; takeda@ncnp.go.jp

　目次：

　　　要約

　　　1.　ウイルスベクターを用いた遺伝子治療

　　　2.　再生移植治療

　　　3.　薬物治療

　　　おわりに

要約：

　筋ジストロフィーとは、進行性に筋肉が壊死・変性し、筋力がなくなってゆく病気の総称です。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）はもっとも頻度の高い筋ジストロフィーです。ほとんどが男児のみに発症しますが、その割合は男児出生約3300人に一人と言われています。
　男性には1つ、女性には二つある、性染色体であるX染色体上には、筋肉の細胞（筋細胞）の骨組み（細胞骨格）をつくるジストロフィンという蛋白の遺伝子があります。遺伝子の異常で、ジストロフィンがほとんど作れなくなるのがDMDです。

　ジストロフィンは筋細胞の骨格を保っているので、DMDでは筋細胞がその形を保てなくなり、容易に壊れるようになります。その結果、筋細胞は崩壊・再生を繰り返し、筋肉としての働きが出来なくなり、筋力低下、筋萎縮を来たします。 DMDの症状は幼児期の起立・歩行障害から始まり、10歳前後で歩くことが出来なくなります。筋力低下による呼吸障害や、同じく筋肉で出来ている心臓の機能障害が死因になることが多く、患者さんは20歳程度で死亡されることが多かったのですが、最近は医療器具や薬物などの医学の進歩により30代、40代まで存命される患者さんもいらっしゃいます。

　残念ながら、この病気の根本的な治療法はまだ発見されていません。しかし最近、分子生物学の進歩により様々な技術が治療に応用できるようになり、加えて筋肉の構造や機能、病気の成り立ちが解明され、全く新しい治療法が考案されるようになりました。

　私たちはDMDの根治療法のためのいくつかの分子治療を考案、実現に向けた実験を進めています。みなさんに、私たちの行っている研究を中心に、筋ジストロフィー治療の将来への展望をご紹介したいと思います。

1. ウイルスベクターを用いた遺伝子治療

　まず私たちは、患者さんの筋肉に欠損しているジストロフィン蛋白を作れるようにする治療を検討しています。
　
　DMDの患者さんのジストロフィン遺伝子は正常なジストロフィン蛋白を作れないので、ジストロフィン蛋白が作れるような遺伝子を補充すればよいわけです。問題は、どうやって遺伝子を補充するか（遺伝子導入法）です。たくさんの筋肉に一番効率よく導入するためには、自然界に存在するウイルスを安全なものに改造して使う方法が一般的です。いろいろなウイルスがベクター（遺伝子を核の中に導入するための道具のことをこう呼んでいます）として使われていますが、私たちはアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus、AAVと略します）という、人に対して病気を起こさせることのない無害なウイルスをベクターに用いています（図1）。

図1.AAVベクターを用いた筋肉への遺伝子導入（模式図） 　ここでは筋肉へのマイクロジストロフィン導入を例として模式化した。導入遺伝子（赤実線）を持つAAVベクターは筋細胞表面の受容体に結合し、細胞内に取り込まれ核に移行する。核で導入遺伝子は翻訳されマイクロジストロフィン（波線）が細胞膜に発現する。AAVベクターの筋細胞膜の受容体はウイルスの血清型で異なり、ヘパリン硫酸やシアル酸などの細胞表面蛋白であると考えられている。

　
AAVは、通常のウイルスで生ずる染色体への組み込みがほとんどないこと（これは、組み込まれた遺伝子が他の正常な機能を損なったり、癌や白血病を起こしたり、あるいは不必要に子孫に遺伝する危険がないと言うことです）と、効果が持続することで、DMDをはじめとしたさまざまな疾患への実用化が期待されています。

　しかしDMDへの治療として実用化するにはいくつか問題がありました。一つは、ジストロフィン遺伝子全部を運べないという問題です。ジストロフィン遺伝子は全長が14Kbという長さなのですが、AAVが運べる大きさは4.7Kbまでです（kbというのは遺伝子の長さを表す単位です。遺伝子配列を決める核酸の一対を1bp, 1000bpで1kbと言います）。AAVに限らず、ジストロフィン遺伝子の全長をベクターに運ばせる（組み込む、と言います）のは大きすぎて大変むずかしいのです。

　そこで、私たちはジストロフィン遺伝子の、必要不可欠な部分だけを使うことを世界で初めて考えつきました。ジストロフィン遺伝子の頭側（5’側；翻訳が始まる部分）としっぽ側は重要な機能があることがわかっているため、真ん中の部分を削らなくてはいけません。

　真ん中の部分のうち、あまり重要でない場所はどこかと考えた際、あるBecker型筋ジストロフィー（BMD）の患者さんのジストロフィン遺伝子がヒントになりました。BMDは、DMDのように全くジストロフィンが出来ないわけではなく、不完全なジストロフィン蛋白が出来ています（詳細は、埜中先生のページを参考にしましょう→http://www.ncnp.go.jp/hospital/news/kin210.htm）。

　BMDの患者さんで、症状がほとんど目立たないのにジストロフィン遺伝子の真ん中の部分が大きく欠けている人が発見されたのです。その患者さんのジストロフィン遺伝子は、正常では14Kbの正常ジストロフィンに対して、6.4Kbという長さであることがわかりました。つまり、この患者さんが持っていた短いジストロフィン蛋白はほぼ正常な機能が残っていたのです。この6.4Kbの、“ミニジストロフィン”遺伝子さえ導入できれば、DMDの重い症状からは免れられるはずだと私たちは考えました。

　しかし、ベクターに組み込むにはこの遺伝子でも大きすぎたので、さらに真ん中や端を削って、4.7Kb以下の短縮型ジストロフィン（以下“マイクロジストロフィン”と呼びます）をつくりました（図2）。

図2.デュシェンヌ型筋ジストロフィーの遺伝子治療に用いられる遺伝子の構造 　全長型ジストロフィン遺伝子は14 kbと長大であり、ごく軽症のBecker型筋ジストロフィーから見出されたミニジストロフィン遺伝子にしても6.4 kbある。私たちはジストロフィン遺伝子のうちアクチン結合部位、システインリッチドメイン、C末端を保ったまま、中央のロッドドメインを短縮し、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターに導入可能な4.7 kb以下のマイクロジストロフィン遺伝子（CS1, AX11, M3）を作製した。 　一方、ユートロフィンはジストロフィンと構造が類似しており、ジストロフィンの代替品として、薬物療法に用いることが出来ると期待されている。

　
ここまで短くしたマイクロジストロフィンが実際に治療効果を持つのかどうか、確認する必要があります。そこで、DMDのモデルとなるマウスにマイクロジストロフィンを導入して強制発現させました（このように、遺伝子を強制発現させたマウスをトランスジェニックマウスと呼んでいます）。

　このモデルは、全身の筋肉にくまなく大量にウイルスベクターで遺伝子導入したのと同じ効果を示すはずです。すると、マイクロジストロフィンを強制発現させたマウスでは、筋肉の変性像、筋肉の強さ、および筋肉の崩壊の指標であるCK (クレアチンキナーゼ)の値が、正常のマウスと差が見られなくなるまで改善していました（図3）。

図3. マイクロジストロフィン遺伝子によるmdxマウスの症状改善 　マイクロジストロフィン遺伝子（CS1, AX11, M3）（図１参照）について、トランスジェニックマウスを作成した。 　更に、同トランスジェニックマウスをジストロフィンを持たないmdxマウスと交配して、全長型ジストロフィンが全くない状態で、筋ジストロフィーの表現型を検討した（上段）。 　3.7kbのM3、4.4kbのAX11では筋ジストロフィー症状の改善効果はみられなかったが、4.9kbのCS1では著明に改善していた。 筋ジストロフィーによる変性によって生ずる中心核線維の頻度を指標とする検討（下段）でも、CS1を導入したトランスジェニックマウスでは、mdxマウスに比べて有意に減少し、コントロールの正常マウス（C57BL/10）とは差がなかった。

　これは、もしベクターを効率よく全身の筋肉に遺伝子を導入できれば、導入された細胞は正常に近い機能をもつ可能性を示したものです。さらに、ジストロフィン蛋白の大切な機能である、他の様々な結合蛋白との結合も確認できました。　今、私たちは作成したマイクロジストロフィンをAAVベクターに組み込んで、筋肉内注射でどの程度の症状の改善が見られるかを観察しています。

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2.　再生移植治療

　ウイルスベクターを用いた方法を実用化するためには、いくつか問題点が残っています。たとえば、全身の筋肉（その中には横隔膜や心臓の筋肉という、直接注射しにくいところも含まれています）にどうやってベクターを行き渡らせるか、あるいはウイルスベクターが異物として体内の免疫系に除去されるのをどうやって防ぐか、などの点です。輸血や骨髄移植のように、正常な筋肉の細胞そのものを移植する方法はないものでしょうか。　

　最近、DMDのような難病の治療に、未熟な状態の細胞を移植する研究が注目されています。未熟な細胞は、免疫反応を起こしにくく、また点滴するだけで血流にのって全身にたどり着くことができるからです。とくに、side populationと呼ばれる細胞（SP cell）が有効ではないかと期待されています。SP cellは骨髄、筋肉、脳など様々な臓器から採取できる特殊な細胞の集団で、いろいろな組織・細胞に分化してゆく能力のある細胞（幹細胞）が多く含まれています。

　このSP cellを骨髄移植の要領で移植すると骨格筋へも分化することが報告されています。ジストロフィンを持たないマウスに正常マウスの筋肉や骨髄由来のSP cellを静脈内に投与したところ、骨格筋内の少量の細胞がジストロフィンを発現したことが発表されています。同じ方法が人間でも応用できるかもしれません 。SP cellはいろいろな性質を持った異なる細胞の集団と考えられていますが、詳しい性格についてはまだよく分かっていない点も多いので、現在研究が進んでいる最中です（図4）。

図4.骨格筋細胞の増殖と分化 　筋肉が再生するときは、間葉系幹細胞が元になる。この細胞は、骨格筋以外にも、心筋、血液系細胞、骨・軟骨など、様々な組織・細胞に分化することができる。 　間葉系幹細胞のうちの一部が骨格筋系譜の幹細胞、さらに筋芽細胞（myoblast）へと分化した後、融合して筋管（myotube）となり、筋線維（myofiber）へと成熟する。 　筋芽細胞の一部は筋衛星細胞（satellite cell）として不活発な状態で静止している。骨格筋が障害を受けると筋衛星細胞は増殖し、筋衛星細胞同士、またはすでにある筋線維と融合して骨格筋を再生させる。 　この際、一部の細胞は再び筋衛星細胞となる。最近、脳や骨髄から分離されたside population cell（SP cell）が培養細胞系で骨格筋に分化したと相次いで報告されているが、その骨格筋発生または筋再生における位置付けや役割には定見がない。

　わたしたちは、このSP cellの正確な正体を突き止めると同時に、どうやったらSP cellが効率よく筋細胞になってゆくか研究を進めているところです。

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３．薬物治療

　私たちは､DMDに欠損しているジストロフィンとよく似た蛋白質であるユートロフィンを使用した薬物療法の可能性に注目して研究を進めています（図1）。ユートロフィンはジストロフィンに構造が似ている細胞骨格蛋白質ですが、正常では成熟した筋肉には見られず、幼若な筋や再生した筋肉にのみ一過性に発現するだけです。いろいろな実験の結果から、ユートロフィンはジストロフィンの機能をある程度代償できることが分かっていますが、ある程度の期間型つとなくなってしまうもののようです。

　もしDMDの患者さんの筋肉にユートロフィンが存在し続けたら、症状が軽減出来るのではないでしょうか。私たちは、筋肉が感染などによって強い炎症を起こすとユートロフィンが増えることを見出しています。これからユートロフィンの発現にかかわる仕組みを解明し、薬物としてのユートロフィンの治療への実用化を考えています。ユートロフィンの他にも、DMDに対して薬として使える可能性がある物質が考案されています。

　ある種の抗生物質（アミノ配糖体）を大量にmdxマウスに投与すると、マウスの症状がよくなったのです。ｍdxマウスはジストロフィン遺伝子のうちの一カ所が点変異によってそれ以上蛋白への翻訳が起こらない「停止信号」（停止コドンといいます）になっているため、ジストロフィンは途中まで作られても完全な長さにならず不安定なので、すぐに壊れてしまいます。アミノ配糖体を大量に投与すると、この停止信号を読み飛ばしてしまう働きがあるので、全長型のジストロフィンが合成されるという理屈です。

　この方法を用いて早速様々な停止コドンをもつDMD/ BMD患者さんに治験が行われました。残念ながら、投与前後でジストロフィンの発現には変化がありませんでした。これは副作用を考慮して少量しか使用しなかったためかもしれず、副作用の少ない別な薬剤を使ったり、薬を増量したりする試みがなされています。その他に、核の中によく似た配列の遺伝子を入れると、もともとの遺伝子と入れ替わるという現象（相同性組み替え）が生ずることを利用し、変異部分を修復する方法があります。このやり方ではこれまでは発現量が極めて少ないことが問題でしたが、実際にジストロフィンの発現を証明しているグループもあります。

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おわりに

　DMDの治療研究の現状をお話ししました。いろいろな取り組みがなされていること、そして、どの方法も実現は必ずしも容易でないことがおわかりだと思います。困難さの一つに、これまで適切なモデル動物が存在しなかったことがあげられます。マウスの実験でうまくいったことを人に応用しても、不成功なことが多々ありました。

　ジストロフィンを欠損したモデル動物としては、mdxマウスがあり、病態研究にも頻用されてきましたが、DMDと違って小型である上に、比較的軽症で進行性も目立たず、DMD患者さんで大きな問題になる心筋障害もはっきりしません。そこで私たちはモデル動物として、ジストロフィンが欠損している筋ジストロフィー犬に注目してきました。筋ジストロフィー犬は進行性で心筋障害を含む重症の臨床型を示し、人の症状とよく似ています。

　昨年国立精神・神経センター内に筋ジストロフィー犬コロニーが設立されました。目下、私たちは以下の二点について研究しています。ひとつは、これまでお話ししてきたような分子治療が、実際に筋ジストロフィー犬で有効かどうかです。小型の動物であるマウスで効果が見られても、犬や人のような大きな動物でも同様に効果がなければ意味がありません。現在、先程述べたAAVベクターを用いて、遺伝子導入を行っています。また、SP cellを用いた細胞移植治療の計画も立てています。

　もう一つは、DMDの心筋障害の研究です。近年、人工呼吸器などの器具の使用によって、DMDの患者さんの寿命は延びてきました。それに伴って、心筋障害によりお亡くなりになる患者さんの数が増えてきています。心筋は骨格筋と同じようにジストロフィンを持っていますが、骨格筋のように筋細胞同士が融合し合うことがないなど、いくつか特別な性質があります。また、DMDやBMDとおなじジストロフィンの異常で、心筋にだけ障害が出る患者さんの存在も知られています。ジストロフィンの異常がどうして心筋障害を生ずるのか明らかになり、さらにその治療法が解明されれば、たくさんのDMD患者さんの命を救うことができるはずです。

　治療を実現させるため、私たちをはじめとして世界中のあらゆる研究グループが総力をあげて研究しています。これまでにご説明したように、実現には様々な問題点があること、その問題点にようやく解決の手が伸ばされてきたことがおわかりいただけたかと思います。分子生物学の進歩は、これまでの常識を覆した治療法を編み出す可能性があります。しかし常に変わらないのは、一日でも早く、疾患に苦しむ患者さんを何とか救いたいという私たちの願いです。

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